İDRARDA KANTİTATİF ŞEKER TAYİN YÖNTEMLERİ

Deneyin Adı : İdrarda Kantitatif Şeker Tayin Yöntemleri

Deneyin Amacı : İdrar örneğine Benedict Testi ve Causse-Bonnans Testi uygulayarak şeker tayini yapmak.

Teorik Bilgi :

İDRAR ANALİZLERİ

Tanımı: İdrarın fiziksel, kimyasal ve mikroskobik analizlerine idrar analizi denir.

İdrar analizlerinin yapılmasının temel amacı hastalıkların teşhisine yardımcı olmak, hastalık progresinin izlemek, hastalığın tedaviye verdiğini cevabı gözlemektir.

Normal idrar

Sağlıklı bir organizma tarafından üretilen idrar az sayıda kan hücrelerini (eritrosit, lökosit vs.), üriner sistemi kaplayan epitel hücrelerini ve bazı fizyolojik kristalleri içerebilir. Fakat normal idrar ya hiç protein içermemeli veya çok düşük bir miktarda protein içermelidir. Yine, hiyalin kastlar dışındaki kastları da bulundurmamalıdır. Sağlıklı bir organizmanın idrarı sarı renklidir, pH’sı köpek ve kediler için 5.5-7.0, atlar için 7.0-9.0 ve sığırlar için 7.0-8.0, yoğunluğu köpek ve kedilerde 1.015-1.040, at ve sığırlarda 1.020-1.050 arasında değişkenlik göstermektedir.

İdrarın toplanması ve saklanması

Her şeyden önce idrarın alındığı kap temiz ve kuru olmalıdır. Çok çeşitli kaplar kullanılabilmekle beraber güvenli olmasından dolayı ağzı kapaklı plastik kapların kullanılması tercih edilmelidir. İdrar örnekleri başlıca; ürinasyon sırasında, idrar kesesine dıştan palpasyonla basınç uygulayarak, katerizasyonla ve sistosentez yoluyla alınabilir. Sistosentez özellikle kedi ve köpeklerde kullanılan bir yöntem olup, enjektörle abdominal duvarda direk idrar kesesine girilir. Katerizasyon ise at ve sığırlar için tercih edilen bir yöntemdir. İdrar analizlerinin yapılabilmesi için gerekli minimum miktar 12 ml dir. Fakat, 50 ml’lik bir miktar analiz için daha uygundur.

İdrar analizlerinde ideal olan analizlerin ilk yarım saat içinde yapılmasıdır. Çünkü bu sürenin sonunda bakterilerin üremesine bağlı olarak idrarda dekompozisyon şekillenmeye başlamaktadır. Eğer bu süre içinde analizler yapılamayacaksa numuneler buzdolabında ( 4oC) saklanmalıdır. Numuneler buzdolabında 6-8 saatlik bir süreyle saklanabilirlerse de bazı sakıncaları vardır. Örneğin, ürat ve fosfat kristallerinin çökmesi sonucu idrar sedimentinde aranacak diğer komponentlerin görülmesi oldukça güçleşmektedir. İdrardaki dekompozisyonu engellemek için borik asit, formol, timol ve kloroform gibi kimyasal maddeler kullanılabilirse de yapılacak bir çok test bu prezervatiflerden etkilenmekte ve yanlış sonuçların alınmasına neden olabilmektedir. Eğer, veteriner hekim bu maddelerden birini koruyucu olarak idrara kattıysa bunu idrarın içinde bulunduğu kap üzerine mutlaka not etmelidir. Oda ısısında 2 saat tutulan numuneler için idrar analizlerinin yapılması bir anlam ifade etmez. Çünkü idrar bakterilerin üremesi için çok
iyi bir ortam oluşturmaktadır. Bakteri üremesi sonucu idrar bulanık bir renk alır, üre amonyağa parçalanır ve pH artışı gözlenir. Bu değişiklikler diğer analizlerin yapılmasını güçleştirir ve yanlış sonuçlar alınmasına neden olur. Oda ısısında bırakılan idrar numunelerinde pH yükselirken, glikoz ve keton cisimlerin miktarı, kastların sayısı, bilirubin ve ürobilinojen azalır. Glikoz miktarındaki azalma bakteriler tarafından kullanılmasının bir sonucudur. Yine, keton cisimleri diasetik asidin asetona dönüşmesi ve asetonun da evaporasyonu sonucu azalır. Bilirubin biliverdine, ürobilinojen de ürobiline okside olur. Ayrıca, kastların ve diğer kan hücrelerinin miktarı bunların lize olması sonucu azalır.

İdrarın fiziksel muayenesi

İdrarın fiziksel muayenesinde idrarın rengine, kokusuna, köpüklü olup olmadığına, özgül ağırlığına (dansitesine) ve transparant (berrak) olup olmadığına bakılır.

Rengi

İdrar sarı renklidir ve bu rengini yapısındaki ürokromdan alır. Rengin koyu sarı oluşu genellikle idrarın yoğunluğundan kaynaklanır. Atların idrarı içerdiği mukus ve kalsiyum karbonat kristallerinden dolayı diğer hayvanları aksine bulanıktır. Özellikle ateşli hastalıklarda vücuttan atılan su daha çok terleme yoluyla olduğu için koyu renkli idrar görülmektedir. Bazı ilaçlar idrarın renginde değişikliklere neden olduğundan ilaç kullanılıp kullanılmadığı anamnezde mutlaka sorulmalıdır. Yine, hematuri, hemoglobinuri ve bilirubinuri durumlarında idrarda renk değişiklikleri gözlemlenir. Hematuri ve hemoglobinuri olgularının ikisinde de idrar kırmızı renklidir. Kırmızı rengin hemoglobinden mi yoksa eritrositlerden mi kaynaklandığını anlayabilmek için idrarın berrak mı yoksa bulanık mı olduğuna bakılır. Eğer berraksa kırmızı renk hemoglobinden, bulanıksa eritrositlerden kaynaklanıyor demektir.

İdrarın renginde bir solukluğun bulunması bunun dilue bir numune olduğunu gösterir. Bu durumda özellikle diapedes mellitus ve diapedes insipidusu çağrıştırmalıdır. Diapedes mellituslu hayvanların idrarı soluk olmakla birlikte içerdiği glikozdan dolayı dansitesi normalin üzerindedir. Soluk idrar ayrıca böbreklerin idrarı konsantre etme yeteneğini yitirdiği üriner sistem hastalıklarında da karşımıza çıkmaktadır. Bu durumda ise idrarda protein bulunacağından idrar çalkalandığında köpürme olur.

Kahverengi idrar ise idrarda bilirubin olduğunu ve sarılık tehlikesinin bulunduğunun göstergesidir. Bilirubin içeren numuneleri çalkalandığında köpürme gözlemlenir. Bilirubinden kaynaklanan köpürme ile proteinden kaynaklanan köpürmeyi köpükteki sarı rengin canlılığından ayırabiliriz. Bilirubin içeren idrarın köpüğün canlı bir sarı rengi vardır. İdrarda bilirubinin varlığının tespiti oldukça önemlidir. Çünkü, sarılığın klinik olarak belirtileri görülmeye başlamadan önce idrarda bilirubin saptanmasıyla sarılık erken dönemde teşhis edilip tedavi yoluna gidilebilir.

Kahverengi-siyah idrar rengini melanin veya homogentisik asitten almaktadır. İdrar başlangıçta normal renginde olmakla birlikte zamanla siyah bir renk alır. Melanin melanomadan homogentisik asit ise tirozin metabolizmasındaki bir bozukluktan kaynaklanmaktadır.

Kokusu

Normal idrar içerdiği uçucu asitlerden dolayı hafif aromatik bir kokuya sahiptir. Uzun süre bekletilen idrarda bakteriler tarafından ürenin amonyağa yıkımlanması sonucu keskin bir amonyak kokusu şekillenir. Uzun süre bekletilen idrarda ürenin yıkımlanması sonucu oluşan amonyağın yanı sıra proteinlerin kokuşması sonucu keskin amonyak kokusunun yanı sıra dekompose olmuş proteinlerden kaynaklanan hoş olmayan bir koku yaymaktadır.

Özellikle Dieabetes mellituslu hastalarda yağların enerji kaynağı olarak kullanılması sonucu açığa çıkan keton cisimlerinden kaynaklanan aseton kokusu da algılanabilir. Yine bazı amino asit metabolizmasındaki bozukluklarda idrar lahana, bozulmuş veya kızartılmış balık kokusu algılanabilir. Hayvanların tükettiği yem maddesinin de idrarın kokusu üzerine etkisi bulunmaktadır. Bundan dolayı anamnez alınırken tüketilen yem hayvan sahibine sorulmalıdır.

Yoğunluğu (Özgül ağırlığı)

İdrarın dansitesi ürinometre veya dansitometre denilen içinde ağırlık maddesi olarak civa içeren spesifik aletler tarafından ölçülmektedir. Ayrıca refraktometre veya hazır stiklerle de dansite ölçümü mümkündür. Sağlıklı köpek ve kedilerde 1.015-1.040, at ve sığırlarda 1.020-1.050 arasında değişkenlik göstermektedir. Eğer böbrek epitelleri uygun olarak çalışmazsa idrar üriner sistem tarafından konsantre edilemez ve dansite düşer. Fakat idrar dansitesindeki düşüklük her zaman böbreklerin iflasından değil, bazen de aşırı su alınımı sonucu idrar dansitesi düşebilmektedir. İdrarın dansitesi numune içersinde çözünmüş halde bulunan substanzlarla ( üre, NaCl vs.) korrelasyon gösterir.

İdrarın Kimyasal Muayenesi

İdrarda Glikoz

Glomeruluslar kanda bulunan bütün glikoz için geçirgendirler, fakat glomerular eşiği aşan hemen bütün glikoz molekülleri tubuluslar tarafından tekrar geri emilir. Bunda dolayı idrarda ölçülebilir seviyede glikoz bulunması idrarın patolojik olduğuna işaret eder. Bu durum özellikle Diabetes mellituslu hastalarda görülür. Bu hastalarda kan glikoz seviyesi çok arttığından glomeruluslardan geçen glikoz miktarı tubulusların resorbe edebildiği glikoz miktarını aşmaktadır. Bunun yanında hiperglisemide, üriner sistem hemorajilerinde glikozüri görülebilir. Köpekler yüksek miktarlarda C vitamini sentezleyebildiklerinden idrar glikoz tayinlerinde yanlış sonuçlar alınabilir. Yine sistitisli kedilerin idrarlarında yapılan glikoz tayinleri de doğru sonuçları yansıtmayabilir. Yine korku, şok ve aşrı heyecan hallerinde, civa klorür zehirlenmelerinde, ağır eksersizler sonucu, beyin tümörlerinde, kafatası kırıklarında, akut ve kronik pankreatitiste, hipertroidizimde ve kuduzda glikoüri görülebilmektedir.

Bir sıvının idrar olup olmadığının anlaşılması

Veteriner hekimlikte zaman zaman vücuttan alınan sıvının idrar olup olmadığının anlaşılması gerekli olmaktadır. İdrar için karakteristik olan üre ve ürik asidin aynı zamanda bir sıvıda bulunması bu sıvının idrar olduğunun veya buna idrar karıştığının delilidir. Bir de buna kreatinin varlığı eklenirse muayene edilen sıvının idrar olduğuna kesin olarak karar verilir.

Kantitatif Metotlar

1. Causse-Bonnans Testi

Fehling A çözeltisi : Bir beherde 35gr CuSO4.5H2O 500ml suda çözülür ve 5ml D.H2SO4 ilave edilerek ısıtılır. Hacmi saf su ile 1L’ye tamamlanır.

Fehling B çözeltisi : Bir beherde 150gr sodyum potasyum tartarat 500ml destile suda sıcakta çözülür, soğutulur ve üzerine 300ml %33’lük NaOH çözeltisi ilave edilir. Hacmi saf su ile 1L’ye tamamlanır.

Causse Bonnans metodunda Fehling reaktifinin indirgenmesi potasyum ferrosiyanür karşısında yapılır. Esmer renk oluşumu reaksiyonun bittiğini gösterir. Bir balon içerisine pipetle Fehling A çözeltisinden 10ml, Fehling B çözeltisinden 10ml ve %5’lik potasyum ferrosiyanür çözeltisinden 5ml konur. Üzerine 30-40ml distile su ve kaynamayı düzenlemek için 2-3 parça sünger taşı ilave edilir. Balon küçük alevde hafifçe kaynatılır. Daha önce bir bürete doldurulan sulandırılmış veya sulandırılmamış idrardan damla damla ilave edilir. Başlangıçta damlaların sayısı çokça olabilir. Reaksiyonun sonuna yaklaştıkça damlaların sayısı azaltılmalı, aradaki zaman uzatılmamalıdır.

Düzgün ve hafif bir şekilde kaynamakta olan balon üzerine idrar damlaları ilave edildikçe Fehling reaktifinin mavi rengi yavaş yavaş değişmeye başlar. Önca sarı daha sonra esmer bir renk oluşur. Esmer rengin oluşumu reaksiyonun bitişini gösterir. Sarfedilen idrarın ml. miktarı kaydedilir.

2. Benedict Metodu

Benedict kantitatif reaktifi : 25gr susuz Na2CO3 200ml suda ısıtılarak çözülür. Üzerine 50gr sodyum veya potasyum sitrat ve 31.25gr KSCN ilave edilerek çözülür. 4.5gr CuSO4.5H2O’un 20 ml sudaki çözeltisi bu çözeltiye sürekli çalkalama ile ilave edilir. 1.25ml %5’lik K4Fe(CN)6 çözeltisi eklenip oda sıcaklığına kadar soğutulur. Su ile hacmi 250ml’ye tamamlanır.

Kalitatif glukoz aranmasındaki Benedict reaktifi ile buradaki kantitatif reaktif arasında fark vardır. Kantitatif reaktife ayrıca potasyum sulfosiyanür ve potasyum ferrosiyanür ilave edilir. İndirgenme bittiği zaman bakır sulfosiyanürden ibaret (CuSCN) beyaz bir çökelek oluşur. Ferrosiyanür bakır hidroksitin çökelmemesini sağlar. Bu reaktif uzun süre dayanır.

Deneyin Yapılışı :

1.Yöntem : Benedict Kantitatif Testi

Bürete seyreltilmiş idrar konur (%1’lik). Erlene 5-10gr arası Na2CO3 eklenir. Kaynama taşı ilavesinden sonra bek alevinde ısıtılır. Daha sonra kaynama sıcaklığını yitirmeden titrasyon yapılır. Titrasyon sonu beyaz çökeleğin oluştuğu andır.

2.Yöntem : Causse-Bonnans Testi

Erlen Fehling A Fehling B Potasyum ferrosiyanür Kaynama taşı

2.5ml 2.5ml 1.25ml Birkaç tane

Yukarıdaki işlemler yapıldıktan sonra erlen bek alevinde hafif kaynamaya başlayana kadar ısıtılır. Kaynama başlayınca büretteki seyreltilmiş idrar (%1’lik) ile titre edilir. Esmer renk oluşumunun gözlendiği ml hacmi kaydedilir.

Hesaplamalar :

1.Yöntem

1gr glukozda 6.7ml = S

0.05.100/6.7 = %0.746

2.Yöntem

6.2ml toplam miktar = S

100ml de 0.75gr olacak şekilde

0.042.100/6.2 = %0.677

Yorum :

Birinci yöntemde ferrosiyanür varlığında fehling çözeltisinin indirgen maddelerce indirgenmesi prensibini kullandık.